唐本忠院士团队《ANBR》：调控固态分子运动构筑还原酶响应的AIE荧光探针

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聚集诱导发光材料由于聚集态下具有高的荧光量子产率，目前在光电器件、化学传感、过程监测、细胞成像和生物探针等诸多领域都取得重要研究进展。然而，聚集态下高的荧光强度却使得此类材料应用在基于固态基质的分析检测设备中遇到难题，即很难实现点亮型探针在固态基质中的应用。因此，发展固态或者聚集态下荧光处于暗态同时能被特定底物点亮的AIE荧光探针(Pro-AIEgen)迫在眉睫。另一方面，唐本忠院士课题组近年来在固态分子运动调控这个研究方向上实现重大突破，例如他们设计合成了一系列具有长烷基链和多分子转子的有机分子，利用长烷基链可以减弱分子间作用力的特点，进而通过分子运动有效猝灭聚集态下的荧光发射，最后获得具有优异光热和光声性能的有机光热转化剂(Nature Communication 2019, 10, 1)。

受此启发，他们引入一个新的分子转子单元-偶氮基团，用于设计在固态或者聚集态下可以有效运作的点亮型AIE探针，即TPE-Azo。相比较于具有四个苯环取代基的四苯基乙烯(Tetraphenylethene，TPE)，TPE-Azo的偶氮基元由于只有两个取代基，因此可以实现更加柔性的分子运动。这一特殊性质，与低分子量的聚乙二醇在室温下为液态是类似的，因为聚乙二醇主链中的氧原子同样为双取代基构型，能够赋予其更加灵活的分子运动。TPE-Azo也可以很容易地通过还原剂的还原作用，通过“去转子”(Derotation)这一特殊过程，生成在固态下可以发射强荧光的TPE-Am，从而在聚集态下实现对还原物质的检测。

图1. (a) TPE-Azo和TPE-Am的相互转化; (b) TPE-Am的四氢呋喃溶液、四氢呋喃/水混合溶液(水含量为99%)和固体粉末在紫外灯激发下的荧光图片; (c) TPE-Azo单晶结构中的分子堆积; (d) 77K和室温下TPE-Azo固体粉末的荧光光谱。

偶氮化合物广泛地应用在光响应的分子开关领域。由于偶氮基团光照下活跃的顺反异构化作用，大多数偶氮化合物呈现弱荧光甚至完全处于荧光暗态。类似地，TPE -Azo在溶液和固态中也都不发光。溶液状态下的TPE-Azo在420 nm蓝光和520 nm绿光交替照射下可以实现顺反构型的可逆转换。同时，TPE-Azo的单晶结构解析表明分子之间只存在弱的C-H⋯N作用，这为激发态下偶氮基团的热弛豫提供了足够的运动空间。通常认为，低温可以限制分子的运动，阻碍TPE-Azo的顺反异构化，从而恢复其固有的荧光发射。TPE-Azo固体粉体在77 K和293 K的光致发光光谱表明，当温度从室温冷却到77 K时，TPE-Azo在650 nm处出现强的红色荧光发射。显然，偶氮基团的分子运动是导致TPE-Azo在溶液和固态中处于荧光休眠状态的重要原因。

图2. (a) TPE-Azo与Na₂S₂O₄反应过程中荧光光谱的变化; (b) TPE-Azo与Na₂S₂O₄反应的荧光动力学曲线; (c) 低氧和常氧条件下HeLa细胞与不同浓度TPE-Azo共培养后的存活率。

TPE-Azo可以在水溶液中形成粒径约为75nm的纳米聚集体，在该聚集态下处于荧光暗态。当它与Na₂S₂O₄共孵育时，可以观察到480 nm荧光发射随着时间推移逐渐增强，溶液的荧光量子产率从0.2%增加到5.7%，表明TPE-Azo可以被Na2S2O4还原，发生“去转子”作用进而点亮TPE-Am的固态荧光。TPE-Azo对其他常见还原剂及生物体内还原性物质表现为化学惰性，包括硫氢化钠、水合肼、谷胱甘肽、半胱氨酸和NADPH等。细胞毒性实验表明，TPE-Azo在高浓度下依旧展现出良好的生物相容性，这为TPE-Azo用于检测细胞内的偶氮还原酶奠定了生物学基础。

图3. (a) TPE-Azo在不同氧气浓度下与HeLa细胞共培养3 h后的共聚焦图像, 包括加入不同浓度还原酶抑制剂(DPI)后的共聚焦图像; (b) 在光敏剂DCQu的存在下，TPE-Azo与HeLa细胞在常氧条件和白光光照下的共聚焦图像。

偶氮还原酶是实体肿瘤缺氧的重要生物标志物之一。考虑到偶氮还原酶的还原性，TPE-Azo因而有可能实现对肿瘤细胞缺氧程度的检测。如图3所示，当氧气浓度从21%下降到0%时，来自HeLa细胞的荧光逐渐增强，这表明TPE-Azo被缺氧条件下高表达的偶氮还原酶分解，释放TPE‐Am点亮细胞。二苯基氯化碘盐(Diphenyliodonium chloride, DPI)是一种典型的偶氮还原酶抑制剂，它可以占据还原酶的活性位点使其失活。在低氧条件下，TPE-Azo与高浓度DPI共培养时，荧光信号明显减弱。这些结果表明，偶氮还原酶可以移除TPE-Azo的偶氮转子，而生成的TPE-Am能够指示生物体环境中的氧气浓度。光敏剂DCQu在白光光照下可以高效地产生单线态氧，这种短时间内的快速耗氧行为可以使得活细胞处于缺氧环境之中。实验表明，TPE-Azo的逐渐解离和TPE-Am的荧光增强可以直观地可视化光动力学治疗(Photodynamic therapy, PDT)过程中产生的缺氧环境。总的来说，本文提出的策略是一种通过调控固态分子运动构建还原酶响应AIE荧光探针的通用策略，其中的荧光团可以被不同的AIE分子代替以实现不同的功能。由于还原酶在很多与活性氧相关的疾病中过表达，因此，这些AIE荧光探针在疾病早期诊断领域具有良好的应用潜力。

图4. TPE-Azo检测细胞缺氧程度的示意图。

以上相关成果以“Turning on Light Emission of a Dark Pro-Aggregation-Induced Emission Luminogen in Aqueous Media Through Reductase-Modulated Derotation”为题发表在Wiley旗下最新推出的开放获取期刊Advanced NanoBiomed Research上。文章的第一作者为香港科技大学的徐昌活博士和南方医科大学的邹航博士，通讯作者为唐本忠院士、郑磊教授和赵征教授。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anbr.202000080

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